幽门螺杆菌hpaA 真核表达质粒的构建及鉴定

PCR 扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳,出现1 条清晰的带,大小为700～800 bp ,同预期的结果基本相符。

重组质粒pT2hpaA 的酶切鉴定及测序结果

pT2hpaA 经Sal Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切后,可见7 542 bp和795 bp大小两片段,大小同预计的结果相符。测序结果表明,重组质粒中的hpaA 基因与GenBank 公布的碱基序列一致。

pT2hpaA质粒的检测

大量抽提pT2hpaA 质粒,琼脂糖电泳显示带型完整;紫外分光光度计检测,A260PA280 = 11865 ,质粒含量约为113 mgPml 。

检测HpaA 蛋白的表达

Western blot 检测转染后的CHO 细胞培养上清,在分子量约为30 000位置呈现抗原抗体反应,提示转染后的细胞能够表达HpaA 蛋白(图2)。

讨论

Hp在人群中的高感染率及其对人类健康的危害 性引起广泛关注,如何预防和清除Hp 感染是一个重 要问题。抗生素的应用给抗Hp 治疗带来了希望,运 用联合药物治疗一般可以有效地清除Hp,但是随着抗 菌药物的使用,使耐药菌株的产生及药物的毒副作用 等诸多问题暴露出来。同时药物根除Hp 后,Hp 仍然 能够反复感染人体7 。因此,研究疫苗来预防和治疗 Hp 显得十分重要。

在对Hp 疫苗的研究中,除了对全菌疫苗和蛋白 疫苗的研究外,一些学者也对核酸疫苗做了一些尝试。 Todoroki 等构建了分别编码HspA、B 的核酸疫苗,皮 下免疫C57BL小鼠后,有效地降低了随后攻毒实验中 细菌的定植量。Miyashita等构建了编码过氧化氢酶 的核酸疫苗,通过滴鼻和皮下注射两种方式免疫 C57BL6 ,末次免疫后的3个月的攻毒保护性实验表明: 与对照组相比,实验组小鼠获得了明显的保护,胃粘膜 仅可见少数炎症细胞浸润,胃炎积分明显降低。这些 研究表明,Hp核酸疫苗能够诱导一定的保护性效果。

合理选择抗原是疫苗成败的关键。对Hp 的研究 表明,Hp 在胃粘膜的定植,靠的是Hp 表面配体与胃粘 膜上皮细胞受体的特异性结合。HpaA 是Hp 重要的 粘附素之一,具有表面暴露、抗原保守等特点。另外,HpaA蛋白疫苗免疫动物能够诱导保护性免疫。为此,我们选择HpaA作为Hp核酸疫苗的抗原。将克 隆自Hp11637 的hpaA 基因插入pTCAE 原核2真核穿梭 质粒,并经酶切和测序证实插入目的片段的正确性。 DNA 疫苗编码抗原的表达量是决定其效果的重要因 素。本研究中的pTCAE 质粒带有来源于巨细胞病毒 的CMV 启动子,它具有高效表达的特点。在实验中, 当将pT2hpaA 经电穿孔转染细胞后,Western blot 证实 了具有免疫反应性的HpaA 蛋白的高效表达,同时具 有良好的免疫反应性。此外,载体中含有氨苄青霉素 抗性基因(AMPR) 。据报道,AMPR 中含有确定的两个 拷贝的免疫刺激序列( immuno2stimulatory sequence , ISS),又称为CpGDNA。由于疫苗中CpGDNA 被内吞 入细胞后,可经一系列的过程释放NF2kB 迁至核内启 动相关基因的转录;并可激活不同的MAPK通路发挥 佐剂的作用 。这些为增强疫苗诱导的免疫反应奠 定了良好的基础。

综上所述,本研究构建了Hp hpaA 真核表达质粒, 并通过酶切、测序,以及体外转染实验证实其正确性, 为进一步的免疫实验奠定了基础。